病毒鉴定的方法有哪些？

        从培养的细胞中分离病毒，然后采用免疫荧光和分子生物学技术进行病毒核酸检测已被成功地用于病毒的鉴定。目前最常用的病毒定量检测方法有以下三大类：用于病毒感染力检测的技术，如病毒空斑形成试验，半数组织培养感染剂量TCID50测定和免疫荧光等；病毒核酸和病毒蛋白检测技术，如实时定量多聚酶链反应（qPCR），免疫印迹，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定（ELISA）和血凝试验等；还有就是那些直接对病毒颗粒进行计数的方法，如流式细胞分析或透射电镜技术。

病毒检测方法的局限性

病毒鉴定方法

1. 培养细胞的显微学观察

材料和仪器

细胞生长培养基：含10% FBS(胎牛血清), 4-6 mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等

维持培养基：上述新鲜的细胞培养基，但血清FBS浓度减少至为2%

宿主细胞：铺满单层细胞的8孔培养腔室玻片（chamber slides）

PBS磷酸缓冲液

Bouin's固定液

吉姆萨（Giemsa）缓冲液

吉姆萨（Giemsa）染色液

丙酮，丙酮：二甲苯（2:1），丙酮：二甲苯（1:2），二甲苯

中性树胶

移液枪头 (10 到100 微升)

移液管

生物安全柜（超净台）

二氧化碳培养箱

倒置显微镜

 

实验方案

        接种宿主细胞至Chamber Slides：选择合适的细胞接种密度（比如8-孔Chamber Slides，接种30,000细胞/孔），培养基为细胞生长培养基（10%FBS-DMEM）。轻轻地前后左右摇晃chamber slides使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜，第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。

        制备不同稀释度的病毒液：标记6支无菌离心管，第1管加入990 μl细胞生长培养基，剩下5管加入900μl细胞生长培养基。按以下方法进行梯度稀释：在第1管中加入10 μl病毒原液（稀释度1:100）充分混匀，然后从第1管吸100 μl至第2管中混匀，依次类推，进行10倍梯度稀释。管1至管6的稀释度分别为 10-3 到 10-7。

        感染细胞：吸去培养孔中的培养液，每孔加入0.5 mL维持培养液（2%FBS-DMEM），再加入100 μl不同稀释度（10-2 至 10-7稀释）的病毒液至其中一孔，留一孔不加作为空白对照。将细胞置二氧化碳培养箱37oC 或 34oC 培养1-4周，追踪观察致细胞病变效应（CPE）发生情况。

        吉姆萨染色：一旦观察到细胞病变效应，轻轻地用PBS将细胞洗3次，每次5min，然后加入Bouin's固定液固定10 min。用吉姆萨缓冲液洗3次，然和加入Giemsa染液染色1 h，再用吉姆萨缓冲液清洗后依次用丙酮处理15s，2:1的丙酮-二甲苯处理30s，1:2的丙酮-二甲苯处理30s，最后用二甲苯处理10 min紧接着用中性树胶封片。显微镜下观察CPE，包涵体，细胞融合及病毒空泡形成情况。病毒感染细胞后形成的CPE图片范例可以在很多图谱，网站和博客上找到，例如ASM Microbe Library

 

2.免疫荧光(IF)检测方法

材料和仪器

细胞生长培养基：含10%FBS(胎牛血清), 4-6mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等

宿主细胞：铺满单层细胞的8孔培养腔室玻片（chamber slides）

PBS磷酸缓冲液

一抗

FITC标记的二抗

细胞核染料DAPI

5-4 %多聚甲醛（PFA，pH7.4），或者甲醇

移液枪头 (10 到100 微升)

离心管

生物安全柜（超净台）

二氧化碳培养箱

荧光显微镜

 

实验方案

        接种宿主细胞至Chamber Slides：选择合适的细胞接种密度（比如8-孔Chamber Slides，接种30,000细胞/孔），培养基为细胞生长培养基（10%FBS-DMEM）。轻轻地前后左右摇晃chamber slides使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜，第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。

        病毒感染：每孔细胞加0.1 mL病毒储存液，留一孔不加作为阴性对照。将细胞放回CO2 培养箱，37°C 或 34°C 培养48h。

        免疫荧光染色观察：病毒感染48h后，吸去培养液，将细胞用预冷的甲醇固定5min（也可用新鲜制备的4%多聚甲醛固定）后，用含0.2% triton X的PBS室温破膜5min。将细胞用PBS清洗后，加入推荐浓度的一抗孵育2h，PBS清洗5遍，然后再加入荧光（Alexa fluor 488 或FITC）标记的二抗进行孵育，PBS清洗5遍，加入DAPI染细胞核，在相差及荧光显微镜下观察结果。

 

3.分子学方法

        用实时定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR）来检测流感病毒比终点检测方法更为快捷，且敏感度跟细胞培养法相当甚至更佳

        用分子技术从临床样本中直接对病毒基因组进行鉴定是21世纪的重大发现之一。核酸扩增技术包括PCR、基于核酸序列的扩增(NASBA)和劳伦斯利弗莫尔微生物检测阵列(LMDA)等都无疑是快速检测和鉴定大多数已知人类病毒的领先技术。PCR可以在 体外 将DNA序列的一段特定区域扩增 106倍，因此是一种极其敏感的检测手段。PCR还可以用于病毒RNA的鉴定，只需先将RNA逆转录成DNA，然后再进行PCR分析，这一方法被称之为逆转录PCR（RT-PCR）。

采用特异性的引物鉴定甲型流感病毒。M：Marker，阳性对照（+），阴性对照（-），泳道1-10为扩增的212 bp甲型流感病毒片段

 

         用实时定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR）来检测流感病毒比终点检测方法更为快捷，且敏感度跟细胞培养法相当甚至更佳

Real-time PCR实验原理图