多种PCR方法介绍

        想必在每个学生物的人眼中PCR这个词绝对不陌生，简单的描述为：几个东西加一起，混一混，上个PCR仪就可以坐等产物了。看起来so easy，但想成就PCR不败记录，扩增出各种不同序列，并且扩出来的条带特异性良好，还是需要点功夫的，今天我们就来介绍一下简单又不简单的各种PCR吧！ 

 

高GC含量PCR（GC-rich PCR）

        具有高GC含量（>80%）的模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。高GC含量序列同时也涉及二级结构。因此，高GC含量序列使DNA聚合酶在扩增时卡住，从而影响了DNA的合成。

        为了扩增高GC含量片段，双链模板必须分离，以便引物结合及DNA聚合酶读取序列。为了克服强GC相互作用，最常用的方法是依靠PCR添加剂或共溶剂来帮助DNA变性，如DMSO。这些试剂通常会降低引物的Tm，所以退火温度也需做相应的调整。

        高合成能力的DNA聚合酶由于其与模板的强结合能力，有助于高GC含量模板的PCR扩增。高热稳定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR扩增，因为更高的变性温度，如98℃代替95℃，可促进解链和PCR扩增。

 

长片段PCR（Long PCR）

        长片段PCR通常指扩增大于5 kb的DNA片段。长片段PCR传统上使用Taq DNA聚合酶（为了快速延伸）和高保真酶（为了准确度）的混合物。

        随着高合成能力、高保真DNA聚合酶的发明，长片段PCR现在可在短时间内高准确性的完成。通过与一个强DNA结合蛋白的结合，聚合酶可获得高扩增能力，可在短时间内扩增长片段，如>20 kb gDNA片段。除此之外，极高保真度，如>100xTaq，可确保长片段扩增的低错误率。

当扩增>10 kb的片段时，PCR实验方案可能需要在以下5个关键位置进行适当优化：

1. 确保使用高质量、高纯度的DNA样本。

2. DNA聚合酶的热稳定较低，使用更多量的DNA聚合酶以弥补多次循环中的聚合酶活性损失。

3. 降低退火和延伸步骤的温度，以助于引物结合。

4. 适当增加PCR步骤的时间，以促进模板DNA的完全分离及引物的结合。

5. 适当增加PCR延伸时间确保目的片段的全长扩增。

 

热启动PCR（Hot Start PCR）

        热启动PCR常用于增强PCR扩增的特异性。热启动PCR主要借助一种酶的修饰物，如抗体、亲和配体、适体或化学修饰物，来抑制常温下DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR反应体系配制阶段引物与模板、引物与引物之间的结合能力降低，从而避免了非特异性扩增。由于DNA聚合酶在常温下的活性被抑制，热启动技术为在常温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，而无需牺牲PCR反应的特异性。当反应体系配制好后，在反应初始加热时，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活。激活时间和温度根据DNA聚合酶及热启动修饰物的不同而有所差别。对于某些聚合酶，激活和预变性合并成了一步。

 

 

降落PCR（Touchdown PCR）

        另一种提升PCR反应特异性的方法是调整PCR循环的参数。在降落PCR中，前几个循环的退火温度设定为比引物的最高退火温度（Tm）再高几度。较高的温度有助于避免产生引物二聚体及非特异性引物与模板形成的复合物，因此可以减少不希望出现的扩增。就这一点来说，较高的退火温度可减少非特异性PCR产物，在PCR起始阶段促进特异性的扩增。

        虽然较高的退火温度可阻止引物二聚体形成和非特异性引物结合，但同时较高的退火温度会加剧引物与目标序列的分离，导致PCR的产量降低。为了克服这个问题，在开始的几个循环中，退火温度通常设置为每个循环降低1℃，以获得足量的预期扩增子。当退火温度降低到最佳温度时（通常比最低的引物Tm低3-5℃），剩余的循环都维持此退火温度。通过这种方法，在PCR过程中，所期望的PCR产物得到有选择性的增加，而几乎不会出现非特异性的产物。

 

巢式PCR（Nested PCR）

        巢式PCR是常规PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。在此方法中，需要设计两对引物：一对（外引物）在目标扩增区域的侧翼，而另一对引物（巢式引物）对应于所扩增DNA的准确区域。第一轮PCR的产物之后作为第二轮PCR的模板。如果第一对引物（外引物）由于引物错配扩增出了非特异性产物，第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的另一个好处是这种方法有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。

 

多重PCR（Multiplex PCR）

        多重PCR可实现在同一反应管中同时扩增多个不同的片段。多重PCR不仅意味着节约时间、试剂和样本，同时使得多个扩增子进行同时比较成为可能。当一个反应管中存在多个引物对时，如在多重PCR中，非特异性扩增和扩增效率的降低是最关注的问题，因为反应的优化不可能针对所有的引物对和片段。因此，引物的设计至关重要，以减少错配引起的非特异性扩增。

        引物序列对于目标片段应该是独特的，且所有引物的Tm值差异应在5℃内。在进行多重PCR前，每个引物对应在单个反应中验证其特异性和扩增效率。而且，不同大小的扩增子应在凝胶电泳中可区分开，以便鉴定。除了引物设计和扩增子大小，热启动DNA聚合酶和特殊优化的PCR缓冲液对于多重PCR也是必需的，它们有助于扩增的成功率和扩增的特异性。