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引物合成的步骤及方法介绍

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2019-01-29 13:50:22

Oligo DNA的人工化学合成始于50年代初期，1980年，全自动的固相DNA合成仪面市后，使得快速、高效合成Oligo DNA成为可能，这大大地推动了生物工程技术的蓬勃发展。

现在一般都采用β-乙腈亚磷酰胺化学合成Oligo DNA，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的合成时从3' →5' 方向进行，通常3' 端的第一个碱基结合在Glass担体 (Controlled Pore Glass，CPG)上。其具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

合成步骤

Step1：脱掉附加在CPG担体上的第一个碱基5' -OH基团上的保护基 (DMTr)，准备附加下一个新的碱基；

Step2：活化新的碱基单体 (Phosphoramidite)，准备与第一个碱基进行反应；

Step3：第二个碱基与第一个碱基发生偶联反应；

Step4：将没有反应的第一个碱基的5' -OH加帽封死 (Capping)，使其不再进一步参与反应；

Step5：将核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯 (即将三价磷氧化成五价磷)。

Step6：重复进行Step1～Step5的循环，直至合成完所需的Oligo DNA序列。

Step7:合成结束后，将Oligo DNA分子从CPG上切下，再进行进一步的纯化。

图1 Oligo DNA合成原理。N1代表第一个碱基，N2代表第二个碱基，依此类推。

OD数的确定

一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，也是一种浪费。

引物纯度检测

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。

引物级别选择

应用	引物长度要求	纯度级别要求
一般PCR扩增	< 45 base	PAGE
诊断PCR扩增	< 40 base	OPC，PAGE
DNA测序	20 base左右	OPC
亚克隆，点突变等	根据实验要求	OPC，PAGE，HPLC
基因构建（全基因合成）	根据实验要求	PAGE
反义核酸	根据实验要求	PAGE
修饰引物	根据实验要求	PAGE，HPLC

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