circRNA研究思路及常用数据库

        上一期我们简要介绍了circRNA的生物学功能等，今天，我们接着谈circRNA。既然确认走circRNA这条摸索的路，又为了斩获得国自然基金和高分文章，那小编就根据近几年circRNA研究热点，梳理出常规的科研思路和推荐相应的经典文献，供君详阅。

 

研究思路

1. 探究circRNA的第一步：找寻circRNA

        首先是寻找差异表达的circRNA。通过微阵列分析细胞系中circRNAs的表达谱，寻找一些显著表达的circRNAs，或通过高通量测序或芯片结合RT-qPCR验证筛选出感兴趣的circRNA，包含二代测序建库和RNA深度生物信息学分析。

        其次是进行初步的细胞功能验证。若源于临床样本，在验证组织样本表达差异后，再通过生存曲线、凋亡分析、裸鼠成瘤实验等验证与表型变化一致，或构建circRNA系列表达载体，制备特异性检测circRNA翻译蛋白的抗体进行细胞功能验证。

 

2. 探究circRNA的第二步：摸索功能机制

按照circRNA三大研究热点进行细分，梳理对应的科研思路：

（1）circRNA作为miRNA海绵的研究思路

        circRNA结合miRNA的靶点预测。通过数据库预测circRNA中miRNA潜在结合位点，可采用Arraystar miRNA软件进行初步筛选，再按照DIANA数据库定向筛选。

ceRNA机制验证。通过萤光素酶报告基因确定miRNA可以直接靶向circRNA的3′UTR；RT-qPCR和RIP实验证实circRNA的miRNA sponge功能；RNA FISH实验辅助确认circRNA主要分布在细胞质中；敲除和共转染实验验证ceRNA机制。

        经典文献推荐：此类研究依旧热门，2018年6月发表在Journal of Hepatology（IF=14.911）上的一篇名为“Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma”的研究，揭示了circRNA cSMARCA5在肝癌的发生发展中的机制。

（2）circRNA参与转录调控的研究思路

        circRNA翻译蛋白质进行细胞功能验证。生存曲线、凋亡验证与表型变化的一致性，也可通过基因敲除/过表达探究circRNA的翻译功能。

        circRNA翻译蛋白质的分子机制。进行分子机制研究，揭示生命的深层次奥秘，为人类的健康事业做出贡献。

        经典文献推荐：此类研究比较新颖，2018年3月发表在Journal of the National Cancer Institute（IF=11.238）上的一篇名为“Novel role of FBXW7 circular RNA in repressing glioma tumorigenesis”的研究，揭示了circRNA-FBXW7在内部核糖体进入位点驱动下跨接开放阅读框编码一种新的21kDa蛋白，以及其在抑制胶质瘤肿瘤发生中的新作用。

（3）circRNA参与蛋白结合的研究思路

        探究circRNA与结合蛋白（RBP）的互作。通过RIP或计算机模拟实验筛选出与circRNA相互作用的蛋白，并研究两者的调控关系或下游机制。

        经典文献推荐：此类研究思路简明，2017年3月发表在Theranostics（IF= 8.537）上的一篇名为 “A circular RNA binds to and activates AKT phosphorylation and nuclear localization reducing apoptosis and rnhancing cardiac repair”的研究，揭示了circRNA结合并激活Akt磷酸化和核定位，发挥减少细胞凋亡并增强心脏修复的作用。

 

3. 探究circRNA的第三步：验证和升华

        通常是构建动物模型或追溯临床标本信息，开展体内验证实验，帮助升华circRNA在疾病治疗中研究意义。

 

circRNA常用数据库

        我们身边中总有大咖大牛出没，常能罗列出很多串联的线索，与其退而慕之，不如临渊而渔。推荐使用在线数据库如下，可帮助探索和挖掘更多有用的circRNA信息。

1. circRNADb，网址：http://reprod.njmu.edu.cn/circrnadb，是首个汇总可编码蛋白的环状RNA数据库，共收集了32914条人类外显子环状RNA记录，每条记录都包括基因组位置信息、RNA编辑情况、所对应的基因组序列、IRES序列元件、预测ORF以及相关的参考文献。

2. circRNABase，网址：http://starbase.sysu.edu.cn/，是专门为circRNAs和CLIP-SEQ（HITS-CLIP，PAR-CLIP，iCLIP，CLASH）数据集进行解码miRNA-circRNA相互作用网络的数据库。

3. circlncRNAnet ，网址：http://app.cgu.edu.tw/circlnc/，是整合lncRNA和circRNA的功能网络的在线分析数据库，主要是集合了TCGA数据库20多个肿瘤类型数据，无需编程即可实现在线可视化分析，而且分析模板非常丰富，另外用户也可提交lncRNA和circRNA芯片或测序的表达数据进行自行分析。

        值得注意的是，一般通过RNA深度测序结合软件分析来预测circRNA（常用软件有MapSplice、CIRCexplorer、CIRI、CircBase等）或lncRNA（常用软件有PLEK、 CPAT、CNCI、lncScore等）的假阳性较高，需要通过实验进一步验证。

 

文献分享

题目：Circular RNA BCRC-3 suppresses bladder cancer proliferation through miR-182-5p/p27 axis

期刊：Mol Cancer

影响因子：7.776

        本文作者分析了人体组织circRNA高通量测序结果，确定了膀胱癌相关circRNA-3 ，包括BCRC-3, GenBank: KU921434.1，作为PSMD1基因的候选circRNA。通过qRT-PCR、RNA pulldown、萤光素酶报告基因等技术验证了BCRC-3与mRNA的相互作用。发现BCRC-3在膀胱癌组织和细胞系中表达较低，体内外BCRC-3过表达抑制了BC细胞增殖。值得注意的是，BCRC-3可以直接与miR-182-5p相互作用，作为miRNA海绵促进p27的miR-182-5p靶向3'UTR活性。因此，BCRC-3可作为肿瘤抑制剂，通过miR-182-5p/p27抑制BC细胞增殖。

 

题目：Discovery of Kaposi's sarcoma herpesvirus-encoded circular RNAs and a human antiviral circular RNA

期刊：Proc Natl Acad Sci USA

影响因子：9.504

 

        非编码RNA在宿主-病毒相互作用中具有重要作用，circRNA是一种单链非编码RNA，可诱骗RNA或RNA结合蛋白抑制其功能。在卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)中，circRNA的作用未知。本文作者用不同的PCR引物和RNase R处理特异性circRNA表明，hsa_circ_0001400是一种感染诱导的circRNA，其过表达抑制了KSHV新生感染中病毒基因LANA和裂解基因RTA的表达。接着，作者使用KSHV感染细胞且经过RNase R处理的circRNA进行了circRNA-Seq分析，鉴定到了由KSHV基因组编码的多个circRNA，它们在KSHV感染的内皮细胞和原发性渗出淋巴瘤(PEL)细胞中表达。作者还发现，KSHV circRNA位于病毒裂解基因的ORF内。作者揭示了宿主-病毒相互作用circRNA—人类抗病毒circRNA，它在KSHV感染时被激活，在感染裂解阶段被诱导表达。

 

题目：Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis

期刊：Journal of the National Cancer Institute

影响因子：11.238

        作者通过对脑胶质瘤临床组织标本进行circRNA测序及生物信息分析，发现了脑组织及癌旁组织中有明显差异表达的circRNA，重点关注了抑癌基因FBXW7第3、4个外显子环化后形成的一个circRNA，并命名为circ-FBXW7。随后作者发现circ-FBXW7存在高度保守的内部核糖体插入序列（IRES），并通过实验证实了circ-FBXW7翻译了一个大约21KD的蛋白质，并命名为FBXW7-185aa。通过常规的细胞功能学实验，作者发现circ-FBXW7翻译的蛋白质可以抑制肿瘤细胞的增值。接着作者进一步证实了FBXW7-185aa协调母基因FBXW7产生的蛋白一起调控原癌基因c-Myc的稳定性。最后作者对脑胶质瘤临床组织标本进行检测，统计临床关联性，做了小鼠脑部原位成瘤实验。发现人类细胞中circ-FBXW7可以翻译一个新的蛋白，对胶质瘤有抑制作用并对胶质瘤患者的临床预后有关联性。

 

题目：Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans

期刊：Nature Communications

影响因子：12.353

 

        环状RNA在真核细胞中是广泛表达的，但是其于人类疾病的关系还不清楚。本文作者发现circANRIL（circular antisense non-coding RNA in the INK4 locus）可以通过抑制rRNA的成熟，促进细胞的凋亡，抑制增殖，激活p53通路，达到防止动脉粥样硬化的作用。由于circANRIL来源的lncRNA有结合蛋白的作用，所以作者用Label-free检测了与circANRIL结合的蛋白谱。富集分析发现circANRIL pull-down下来的蛋白主要在核糖体RNA的形成和RNA剪切上。然后作者从显著富集的蛋白中选择了几个与核糖体剪切相关的蛋白，做RIP验证，发现circANRIL可以与rRNA前体竞争结合PES1蛋白，从而使rRNA前体在细胞内聚集，细胞压力增加，引起核仁碎裂，p53的激活，细胞凋亡。