Nature子刊！磷酸化iTRAQ助力PDAC疾病机制研究！
信息来源：金开瑞 作者：genecreate 发布时间：2019-04-04 11:58:29
题目：Exome-wide analysis identifies three low-frequency missense variants associated with pancreatic cancer risk in Chinese populations
期刊：Nature Communications
影响因子：12.353
合作技术：磷酸化iTRAQ
研究背景
胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的人类癌症之一，在世界范围内，PDAC的发病率逐年增加，5年生存率仅为5%，在可治愈阶段的预防或早期诊断仍然非常困难。目前对于PDAC的种系编码变异尚未得到系统的研究，因此，增加对PDAC易感性的其他低频或罕见变异的鉴定将有助于加深对该疾病病因的理解。
研究内容及结果
1. PDAC鉴定三个低频错义SNP
在该研究的发现阶段，作者对943名PDAC患者和3098名健康对照者进行了外显子组关联分析（图1），其中25个变体表现出有希望的关联。因此，作者选择这25种变体进一步分析，最终确定了三种与PDAC风险显著相关的低频编码变体，并通过逻辑回归分析中的加性模型显示P值达到全基因组显著性。其中，rs34309238最为显著，它位于染色体19p13.12 中PKN1的第11外显子；DOK2的第4个外显子中的rs2242241变体和APOB的第28个外显子中的rs183117027变体也与PDAC的风险增加相关（图2）。
期刊：Nature Communications
影响因子：12.353
合作技术：磷酸化iTRAQ
研究背景
胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的人类癌症之一，在世界范围内，PDAC的发病率逐年增加，5年生存率仅为5%，在可治愈阶段的预防或早期诊断仍然非常困难。目前对于PDAC的种系编码变异尚未得到系统的研究，因此，增加对PDAC易感性的其他低频或罕见变异的鉴定将有助于加深对该疾病病因的理解。
研究内容及结果
1. PDAC鉴定三个低频错义SNP
在该研究的发现阶段，作者对943名PDAC患者和3098名健康对照者进行了外显子组关联分析（图1），其中25个变体表现出有希望的关联。因此，作者选择这25种变体进一步分析，最终确定了三种与PDAC风险显著相关的低频编码变体，并通过逻辑回归分析中的加性模型显示P值达到全基因组显著性。其中，rs34309238最为显著，它位于染色体19p13.12 中PKN1的第11外显子；DOK2的第4个外显子中的rs2242241变体和APOB的第28个外显子中的rs183117027变体也与PDAC的风险增加相关（图2）。
图1 技术路线
图2 遗传变异和胰腺癌风险之间关联分析
2. rs34309238变体可能影响PKN1磷酸化
在已确定的三个变体中，作者预测rs34309238变体（Leu555Ile）PKN1可能具有破坏性，并且已报道的三个磷酸化位点（S559、S561和S562）位于该变体附近，因此它们的磷酸化水平可能受到影响（图3a）。此外，作者通过对Oncomine数据库和人类蛋白质Atlas数据库分析发现，PKN1在许多癌症中表达上调，如神经胶质瘤、肾癌、卵巢癌、前列腺癌和PDAC。因此，作者推测rs34309238 C>A 变化可能通过影响磷酸化PKN1的水平并激活下游信号传导途径而影响PDAC发病风险。
在已确定的三个变体中，作者预测rs34309238变体（Leu555Ile）PKN1可能具有破坏性，并且已报道的三个磷酸化位点（S559、S561和S562）位于该变体附近，因此它们的磷酸化水平可能受到影响（图3a）。此外，作者通过对Oncomine数据库和人类蛋白质Atlas数据库分析发现，PKN1在许多癌症中表达上调，如神经胶质瘤、肾癌、卵巢癌、前列腺癌和PDAC。因此，作者推测rs34309238 C>A 变化可能通过影响磷酸化PKN1的水平并激活下游信号传导途径而影响PDAC发病风险。
图3 PKN1 rs34309238变体通过改变磷酸化PKN1的水平并影响FAK / PI3K / AKT信号传导途径来影响胰腺癌风险
3. rs34309238-A激活PKN1 / FAK / PI3K / AKT途径
为了阐明rs34309238在PDAC发展中的作用，作者使用含有PKN1 rs34309238 [C]、 rs34309238 [A]的pcDNA3.1质粒转染PANC-1细胞，并进行磷酸化iTRAQ相对定量蛋白质组学分析。结果发现和PKN1 [C]组、对照载体组相比，PKN1 [A]中Ser561和Ser562磷酸化水平增加。此外，FAK（FAK Tyr397）、PI3K调节亚基α（PI3KR1 Ser83）、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1 Ser241）以及PKN1 [A]转染后的丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT Ser473）的磷酸化水平皆有所增加（图3b）。WB实验进一步验证了FAK Tyr397和AKT Ser473的磷酸化水平增加结果（图3c）。同时，siRNA敲低PKN1后可以降低磷酸化FAK Tyr397和AKT Ser473水平（图3c）。
4. rs34309238-A促进PDAC细胞增殖
为了进一步表征PKN1变体在PDAC细胞中的功能，作者在PANC-1和BxPC-3细胞中过表达不同的PKN1变体并检测细胞增殖速率。结果发现与过表达PKN1 [C]组、对照载体组相比，过表达PKN1 [A]可以显著促进PANC-1和BxPC-3细胞的增殖（图4a，b）；敲低PKN1则会抑制PANC-1和BxPC-3细胞的增殖（图4c，d）。此外，作者还选择了两个已报道的PKN1抑制剂（Lestaurtinib、Ro318220）并验证它们是否可以抑制PDAC细胞的增殖。结果显示，Lestaurtinib和Ro318220均通过降低磷酸化FAK / PI3K / AKT水平来抑制PANC-1和BxPC-3细胞的增殖（图3d和图4e、f）。
为了阐明rs34309238在PDAC发展中的作用，作者使用含有PKN1 rs34309238 [C]、 rs34309238 [A]的pcDNA3.1质粒转染PANC-1细胞，并进行磷酸化iTRAQ相对定量蛋白质组学分析。结果发现和PKN1 [C]组、对照载体组相比，PKN1 [A]中Ser561和Ser562磷酸化水平增加。此外，FAK（FAK Tyr397）、PI3K调节亚基α（PI3KR1 Ser83）、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1 Ser241）以及PKN1 [A]转染后的丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT Ser473）的磷酸化水平皆有所增加（图3b）。WB实验进一步验证了FAK Tyr397和AKT Ser473的磷酸化水平增加结果（图3c）。同时，siRNA敲低PKN1后可以降低磷酸化FAK Tyr397和AKT Ser473水平（图3c）。
4. rs34309238-A促进PDAC细胞增殖
为了进一步表征PKN1变体在PDAC细胞中的功能，作者在PANC-1和BxPC-3细胞中过表达不同的PKN1变体并检测细胞增殖速率。结果发现与过表达PKN1 [C]组、对照载体组相比，过表达PKN1 [A]可以显著促进PANC-1和BxPC-3细胞的增殖（图4a，b）；敲低PKN1则会抑制PANC-1和BxPC-3细胞的增殖（图4c，d）。此外，作者还选择了两个已报道的PKN1抑制剂（Lestaurtinib、Ro318220）并验证它们是否可以抑制PDAC细胞的增殖。结果显示，Lestaurtinib和Ro318220均通过降低磷酸化FAK / PI3K / AKT水平来抑制PANC-1和BxPC-3细胞的增殖（图3d和图4e、f）。
图4 PKN1 rs34309238变体对胰腺癌细胞增殖影响
文章小结
在本研究中，作者使用Illumina HumanExome Beadchip对PDAC的编码易感基因位点进行外显子组检查并确定与PDAC易感性显著相关的三种低频编码变体。在进一步的功能分析中，作者结合磷酸化iTRAQ相对定量蛋白质组学技术，首次发现rs34309238变体通过促进磷酸化PKN1的水平并激活FAK / PI3K / AKT信号传导途径来增加PDAC患病风险。这些发现强调了罕见编码变体在PDAC发展中的重要性，有助于将来对该疾病的预防和治疗。
解析文献
Jiang Chang, Jianbo Tian, et al. Exome-wide analysis identifies three low-frequency missense variants associated with pancreatic cancer risk in Chinese populations[J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 3688.
在本研究中，作者使用Illumina HumanExome Beadchip对PDAC的编码易感基因位点进行外显子组检查并确定与PDAC易感性显著相关的三种低频编码变体。在进一步的功能分析中，作者结合磷酸化iTRAQ相对定量蛋白质组学技术，首次发现rs34309238变体通过促进磷酸化PKN1的水平并激活FAK / PI3K / AKT信号传导途径来增加PDAC患病风险。这些发现强调了罕见编码变体在PDAC发展中的重要性，有助于将来对该疾病的预防和治疗。
解析文献
Jiang Chang, Jianbo Tian, et al. Exome-wide analysis identifies three low-frequency missense variants associated with pancreatic cancer risk in Chinese populations[J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 3688.
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