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【客户文献分享】LINC01207和miR-143-5p的竞争机制促进胰腺癌细胞的自噬和凋亡

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2019-05-30 16:21:52

题目：Long non-coding RNA LINC01207 silencing suppresses AGR2 expression to facilitate autophagy and apoptosis of pancreatic cancer cells by sponging miR-143-5p

期刊：Molecular and Cellular Endocrinology（IF=3.56）

合作技术： RNA pull down+RIP

研究背景

胰腺癌是一种严重的恶性肿瘤，伴随着显著地结缔组织增生和间质反应，且5年内相对生存率很低。尽管已发现炎症过程是胰腺癌发展的关键调节器，但由于缺乏筛查的成像方式和特定标志物，导致早期胰腺癌较难被诊断；通常而言，手术是可切除胰腺癌中期最快速的治疗方法，但患者由于药性、转移率高、预后不良和癌症复发等因素，导致继续面临着不利结果。在本篇文献中，重点探究长链非编码RNA（LINC01207）在胰腺癌细胞自噬和凋亡中的作用，及其与miR-143-5p相互作用的调节机制；并初步确定了lncRNA的表达谱和与胰腺癌相关的基因，为胰腺癌治疗提供一个潜在靶点。

研究内容及结果

1. 在胰腺癌和癌旁组织中LINC01207、miR-143-5p和AGR2表达水平的变化

首先通过免疫组化检测AGR2蛋白的表达情况，在光学显微镜下AGR2蛋白的阳性表达显示为棕黄色，且在癌组织中的蛋白阳性率大于癌旁组织（图1A-1C），可初步得到在胰腺癌中AGR2蛋白表达上调。

接着通过分析胰腺癌的基因综合表达谱（GEO），其热图数据显示出AGR2确实是显著上调的基因（图2A-2D）；进一步分析微阵列GSE16515数据库，发现LINC01207变化与AGR2呈正相关（图2E-2F）；再通过RT-qPCR检测得到在胰腺癌中LINC01207和AGR2高表达、而miR-143-5p低表达（图2G）。

图1 胰腺癌组织中AGR2的阳性表达上调

图2 前列腺癌中circRNAs的表征和鉴定

2. 互作实验验证出miR-143-5p可特异性与LINC01207和AGR2结合

调取出RNA22网站中LINC01207与miR-143-5p、miR-143-5p与AGR2的预测结合位点信息（图3A-3B）；构建双荧光素酶的报告基因，发现LINC01207-Wt与miR-143-5p mimic、AGR2-Wt与miR-143-5p mimic共处理时均显著地降低了荧光素酶活性（图3C-3D）；再通过RNA pull-down和RIP-qRCP正反验证实验，得出LINC01207和miR-143-5p的结合关系以及miR-143-5p和AGR2的靶向关系。

图3 miR-143-5p可特异性与LINC01207和AGR2结合

3. 初步探究LINC01207、miR-143-5p和AGR2的调控机制

通过RT-qPCR和WB检测了在五个细胞株中AGR2的表达情况，筛选出最佳的Mpanc-96细胞株供进一步应用（图4A-4C）。接下来，采用RT-qPCR分析Mpanc-96细胞株中LINC01207、miR-143-5p和AGR2的表达模式，得到沉默LINC01207可以降低LINC01207与miR-143-5p结合情况，进而导致mir-143-5p高表达和AGR2低表达（图4D）。

图4 选择Mpanc-96细胞株来探究LINC01207、miR-143-5p和AGR2的调控机制

4. 深度探究LINC01207、miR-143-5p和AGR2的调控机制

一方面，采用免疫荧光染色检测LC3II的表达情况，得到siRNA-LINC01207和miR-143-5p mimic治疗后LC3II蛋白表达升高、DyLin 488染色结果呈点状的绿色荧光，而miR-143-5p inhobitor治疗后LC3II蛋白表达降低（图5A）；同时发现siRNA-LINC01207 + miR-143-5p mimic共转染后具有更高的LC3II表达量（图5B）。

另一方面，采用免疫印迹法检测自噬和凋亡相关蛋白（LC3II、P62、beclin-1、Bcl-2、Bax、AGR2，内参GAPDH），同上组别间的趋势比较，得出沉默LINC01207和过表达miR-143-5p可增加LC3II、beclin-1蛋白表达，同时降低P62、AGR2蛋白表达和Bcl-2/Bax蛋白比率，从而诱导胰腺癌细胞自噬和凋亡（图6A-6B）。

图5 抑制LINC01207和升高miR-143-5p可促进胰腺癌中LC3II的表达

图6 抑制LINC01207和升高miR-143-5p可促进胰腺癌细胞凋亡和自噬

5. 细胞功能学验证了抑制LINC01207和升高miR-143-5p对胰腺癌细胞生长的影响

首先采用MTT法检测细胞生长情况，生长曲线显示siRNA-LINC01207 + miR-143-5p mimic联合治疗对胰腺癌细胞的生长有较强的抑制作用（图7A）。其次采用TUNEL染色法检测细胞凋亡情况，在高倍镜下选择200个细胞计算阳性细胞的百分比，统计结果显示80nM siRNA-LINC01207单独或与miR-143-5p mimic联合治疗能显著地促进胰腺癌细胞凋亡（图7B-7C）；同时采取流式细胞术也得到了一致的结果（图7D）。最后采用吖啶橙染色来计算酸性自噬囊泡细胞的比例，通过在荧光显微镜下观察和统计，得到siRNA-LINC01207 + miR-143-5p mimic联合治疗可促进胰腺癌细胞自噬（图7E-7F）。总的来说，抑制LINC01207和升高miR-143-5p能促进胰腺癌细胞的凋亡并引起自噬效应。

图7 细胞功能学验证LINC01207和miR-143-5p对胰腺癌细胞生长的影响

文章小结

本文旨在探究LINC01207在肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭中作用机制，通过胰腺癌的基因综合表达谱（GEO）筛选出显著上调的基因AGR2；再根据GSE16515数据集和分子验证得到LINC01207变化与AGR2呈正相关；然后测定胰腺癌和癌旁组织中AGR2、LINC01207和miR-143-5p的表达模式，并验证出LINC01207和miR-143-5p的结合关系以及AGR2和miR-143-5p的靶向关系；最后通过自噬和凋亡相关的细胞功能指标进一步确认机制。综上所述，本研究提供了一个新的视角，沉默LINC01207即可通过削弱以miR-143-5p为靶向的AGR2表达来抑制胰腺癌的进展，为临床治疗提供一个新的视角。

解析文献

Liu C, Wang JO, Zhou WY, et al. Long non-coding RNA LINC01207 silencing suppresses AGR2 expression to facilitate autophagy and apoptosis of pancreatic cancer cells by sponging miR-143-5p. Mol Cell Endocrinol. 2019 Apr 13. DOI: 10.1016/j.mce.2019.04.004.

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