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多组学联合揭示糖酵解和KEAP1-NRF2信号转导的整合机制

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2019-12-31 11:31:43

期刊：Nature

IF：41.577

技术：定量蛋白质组、靶向代谢组、PRM

研究背景：

细胞代谢和信号调节整合对于维持细胞稳态是极其必需的。细胞内生、固有活性代谢物能够调节蛋白质功能，进而影响细胞的生命活动。KEAP1是一种重要的“亲电性传感器”蛋白，可对内源性和外源性分子做出反应，其共价修饰会导致 NRF2 的累积，从而启动细胞保护基因转录。因此，作者希望能揭示糖酵解和NRF2信号传导之间的直接联系。

研究结果：

1. IMR32细胞表型筛选，确定激活 NRF2信号传导的化合物

为了发现KEAP1-NRF2信号传导途径的非共价调节因子，以及其潜在调节的新作用机制，作者使用NRF2依赖性荧光素酶报告基因（pTI-ARE-LUC）进行了基于IMR32细胞的高通量表型筛选。从多种杂环化合物库中，作者鉴定到一种CBR-470-0化合物，其系列化合物（如CBR-470-1）处理IMR32细胞后可导致NRF2蛋白的积累呈现时间依赖效应（图1b）。根据IMR32细胞（CBR-470-1处理24h后）表达谱显示，最显著富集的基因组是由NRF2靶基因组成的“NFE2L2 targets” （图1c-1d），这表明CBR-470-系列化合物可以在体外诱导NRF2信号通路激活。

接下来，作者进一步确定CBR-470-系列化合物参与体内的诱导过程。Balb/C小鼠口服CBR-470-2化合物，通过qRT-PCR检测在几个器官中NRF2靶基因的表达情况，发现在皮肤中观察到NQO1和HMOX1的转物水平呈现剂量依赖性增加（图1e）。已有研究表明NRF2可以有效防止紫外线照射导致的光老化表型和皮肤癌变，进而作者在急性UV损伤小鼠模型中评估CBR-470-2的活性，发现CBR-470-2可以减少紫外线照射后的小鼠模型表皮厚度，与NRF2细胞保护程序的激活一致（图1g-1h）；由此表明CBR-470-系列化合物可以在体内诱导NRF2信号通路激活。

图1 CBR-470-系列化合物在体外和体内均激活NRF2信号传导

2. CBR-470-1激活NRF2信号传导的机制

为了确定CBR-470-1激活NRF2信号传导的机制，作者合成了含有生物素和二氮杂萘取代基的荧光亲和探针（称为CBR-470-PAP），并使用5μM剂量去处理IMR32细胞1小时，在紫外线照射后进行细胞裂解液的抗生物素蛋白质印迹分析（图2a）；再接着通过生化分离和LC-MS/MS分析磷酸甘油酸激酶1（PGK1）是否作为CBR-470-PAP的潜在靶标（图2b-2c）。体外重组蛋白的结合实验表明CBR-470-PAP选择性标记了PGK1；而IMR32细胞中PGK1蛋白的敲低和过表达实验发现，CBR-470-1处理组的 EC50值分别表现出降低和增加（图2d-2e），且烯醇酶1（PGK1下游的酶）消耗加快；靶向代谢物组学分析发现，CBR-470-1处理的IMR32细胞中PGK1 上游代谢物水平快速增加以及下游代谢物快速消耗；上述结果表明，糖酵解中间体可参与NRF2信号传导，CBR-470-1可通过调节PGK1活性来影响糖酵解途径和NRF2活化过程。

图2 糖酵解依赖 CBR-470-1 激活 NRF2 信号传导

3. MGx介导了糖酵解和KEAP1-NRF2信号通路的直接联系

作者先研究由PGK1直接代谢的1,3-BPG是否可能通过由KEAP1的磷酸甘油基-赖氨酸（PGK）修饰来参与KEAP1-NRF2途径的信号传导。在CBR-470-1处理IMR32细胞30分钟后，1,3-BPG水平升高，KEAP1水平没有明显改变；但是WB结果显示CBR-470-1发生作用依赖于高分子量 KEAP1（HMM-KEAP1）的形成，其分子量大约是单体 KEAP1 的两倍（图3a）。除1,3-BPG外，其他糖酵解的中心代谢产物，如磷酸丙糖异构体D-甘油醛-3-磷酸（GAP）和磷酸二羟丙酮（DHAP），以及它们的非酶解产物甲基乙二醛（MGx），这些亲电羰基化合物都可以作为反应官能团修饰蛋白残基。在这些候选物中，仅有MGx处理的细胞裂解物或活细胞可导致HMW-KEAP1的选择性形成（图3b-3c），并功能性地激活下游NRF2靶基因NQO1和HMOX1的表达（图3d）；同时衍生化MGx的靶向LC-MS检测也证实CBR-470-1处理细胞的最初几小时内MGx水平显著地升高（图3e）。因此上述结果说明糖酵解和由MGx直接修饰KEAP1介导的KEAP1-NRF2信号通路之间存在直接联系。

图3 MGx修饰KEAP1形成共价的高分子量二聚体并激活NRF2信号传导

4. SILAC 定量蛋白质组学和PRM靶向蛋白质组学确定了影响 HMM-KEAP1 形成的关键结构域

接下来，作者进一步选用SILAC 定量蛋白质组学方法确定HMW的结构域和残基（图4a），结果表明NTR（N-末端区域，氨基酸1-50）和BTB结构域（氨基酸150-169）作为可能参与HMW的候选结构域和残基，它们响应了CBR-470-1诱导的HMW-KEAP1二聚体形成过程（图4b-4d）。同时，作者检测了这些结构域内的十多个C-to-S，K-to-M/R和R-to-A突变，以及KEAP1中其他已知的功能残基对HMW-KEAP1形成的影响；结果发现两个精氨酸残基突变（NTR结构域的R15和BTB结构域的R135）显著但不完全地减少了HMW-KEAP1的形成，而BTB结构域中C151S突变对HMW-KEAP1形成的几乎完全抑制（图5a）。由此，作者通过合成一个含有半胱氨酸和精氨酸的模型肽，来确定MGx可能介导上述残基之间的修饰；采用甘氨酸接头分开模型肽，并在生理温度和pH下用MGx处理过夜，可发现形成翻译后修饰出新的甲基咪唑（MICA）。

随后，作者在纯化MICA后通过一系列一维和二维NMR实验证实了其结构（图5d）；并采用CBR-470-1或MGx处理细胞，经过凝胶分离HMW-KEAP1和单体KEAP1后进行LC-MS/MS分析，来确定是否在KEAP1蛋白内发生MICA修饰（图5c-5d）。在来自CBR-470-1和MGx处理的分离的HMW-KEAP1中鉴定了在C151和R135之间具有MICA交联肽，但在分离的单体KEAP1中未鉴定到（图5e）。此外，PRM的并行反应监测也证实了HMW-KEAP1中独特存在的十几个母-子离子跃迁的存在和共洗脱的存在（图5f；图6a-6b）。综上所述，作者发现糖酵解代谢过程是通过反应性糖酵解代谢物MGx与前哨蛋白KEAP1的直接相互作用来偶联NRF2依赖性基因的表达，并形成稳定且新型的翻译后修饰蛋白质来介导糖酵解途径（图5g）。

图4 基于SILAC的KEAP1修饰蛋白质组学表征HMM-KEAP1结构域

图5 甲基乙二醛在KEAP1中的近端半胱氨酸和精氨酸残基之间形成新的翻译后修饰

图6 PRM分析MICA交联肽

研究结论：

作者确定了糖酵解酶PGK1的小分子抑制剂，并揭示了糖酵解和NRF2信号传导之间的直接联系。PGK1的抑制导致活性代谢物MGx的积累，其选择性地修饰KEAP1以便在近端半胱氨酸和精氨酸残基（MICA）之间形成甲基咪唑交联；该翻译后修饰的过程导致KEAP1的二聚化、NRF2的积累和NRF2转录程序的激活。总的来说，在糖酵解和KEAP1-NRF2信号传导之间存在着直接的通信联系，由此更加深入地了解细胞应激反应后的代谢调控机制。

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